廣東省微生物研究所｜詳解化妝品微生物檢驗
接上篇文：“《防腐劑與產(chǎn)品組分相容性研究（一）失靈的挑戰(zhàn)性實驗》”，廣東省微生物研究所謝小保主任從化妝品微生物檢驗的特點、制樣、流程、影響因素、以及可完善建議等多方面帶領(lǐng)大家更深入了解微生物防腐體系以及防腐劑與產(chǎn)品組分之間的關(guān)系，引領(lǐng)企業(yè)積累及提升化妝品防腐劑的綜合應(yīng)用能力。
一、化妝品微生物檢驗 特點：
■ 劑型多
■ 需要加中和劑
■ 需要營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基
二、化妝品微生物檢驗 檢樣制備：
1、液體樣品：
A、水溶性
量取10ml加到90ml滅菌生理鹽水中，如樣品少于10ml，如為5m則加45ml滅菌生理鹽水，混勻后，制成1:10稀釋液。
B、油溶性
取樣品10ml，先加5ml滅菌液體石蠟混勻，再加10ml滅菌的吐溫80，在42～44℃水浴中振蕩混合10min，加入滅菌生理鹽水75ml（在40～44℃水浴中預溫），在40～44℃水浴中乳化，制成1:10的懸液， 分散混懸后，放30～32℃。
2、膏、霜、乳劑樣品：
A、水溶性
稱取10g，加到滅菌的帶玻璃珠加有90ml滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振蕩混勻，放32℃水浴靜置15min，用其上清液作為1:10稀釋。
B、油溶性
稱取10g，放到滅菌的研缽中，加10ml滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加10ml滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加70ml滅菌生理鹽水，在40～44℃水浴中充分混合，制成1:10稀釋液。
3、固體樣品：
稱取10g，加到滅菌的生理鹽水稀釋瓶中，振蕩混勻，是其分散混懸后，放在30～32℃水浴中15min后取出，充分振蕩混合，再放到放在30～32℃水浴中靜置15min，取上清液作為1:10稀釋液。
注：如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、乳劑等，可稱10g樣品加90ml滅菌生理鹽水，均質(zhì)1～2min，疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g 樣品，加10mL滅菌液體石蠟，10mL 吐溫80，70mL 滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min～5min。
三、化妝品微生物檢驗 檢測流程：
1、菌落總數(shù)檢測程序
2、霉菌、酵母菌檢測程序：
3、耐熱大腸桿菌檢測程序：
4、銅綠假單胞菌：
5、金黃色葡萄球菌檢測程序
四、化妝品幑生物檢測影響因素：
1培養(yǎng)基
1、培養(yǎng)基的質(zhì)量對菌落總數(shù)、霉菌與酵母數(shù)檢測結(jié)果有較大影響。
2、不同企業(yè)生產(chǎn)的培養(yǎng)基質(zhì)量有差異，影響檢測結(jié)果。
3、不同企業(yè)生產(chǎn)的培養(yǎng)基對于質(zhì)控菌的檢測差異不明顯。
生理鹽水沒有中和作用，建議改為具有中和作用的稀釋液。
如：SCDLP，MLB
2、TTC
實驗方法：未加入防腐劑的化妝品，放置10天后，再測試化妝品的菌落總數(shù)，采用加入TTC(2 ,3 ,5 - 氯化三苯基四氮唑)和不加TTC的卵磷脂、吐溫80—營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行檢測， 培養(yǎng)基中TTC含量按《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》規(guī)定加入。
結(jié)果表明，培養(yǎng)基中加入TTC和不加TTC，檢測結(jié)果存在較大的差異，膏霜類產(chǎn)品檢測結(jié)果相差66倍，浴液類產(chǎn)品相差2倍，乳液類產(chǎn)品結(jié)果相同，這說明TTC對于產(chǎn)品中的部分自然菌有一定的抑制作用，并對產(chǎn)品中不同種類的細菌抑菌活性不同。
原因分析：TTC影響細菌的生長速度；TTC完全抑制了部分細菌的生長。本實驗室曾對放置過夜的生產(chǎn)用水進行過同樣的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)未加入TTC和加入TTC的檢測結(jié)果最高相差100倍。
在未加入防腐劑的化妝品中加入金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌進行實驗，未加入TTC和加入TTC的檢測結(jié)果相同，說明TTC對質(zhì)控菌沒有抑制作用，因此，根據(jù)質(zhì)控菌測試的結(jié)果評價菌落總數(shù)檢測方法的有效性有一定的局限性。由于原材料和水中的微生物種類非常多，每種菌對TTC的敏感性不同，造成TTC對不同的化妝品檢測結(jié)果的影響存在差異。
3、中和劑
實驗方法：在添加質(zhì)控菌的實驗中,使用20種化妝品試樣，其中膏霜類6種，浴液類6種,乳液類8種，這些化妝品都含有防腐劑，菌落總數(shù)按《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》規(guī)定進行，實驗結(jié)果見下表。
從結(jié)果可以看出，稀釋10倍時，平板上沒有菌落生長，說明化妝品中防腐劑抑制了細菌的生長，常規(guī)檢測法中的卵磷脂和吐溫80沒有完全中和防腐劑的抑菌性能，稀釋100倍時，膏霜類還有兩種化妝品沒有檢出添加的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，說明這兩種化妝品中的防腐劑還具有抑菌作用，其它品牌的化妝品則菌落大量生長，說明在100倍的條件下，防腐劑對添加的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌沒有抑菌作用。因此，兩種膏霜類化妝品的檢出限大于100cfu/g,其它種類的化妝品的檢出限大于100cfu/g。
4、中和劑對添加質(zhì)控菌檢出限的影響
從結(jié)果可以看出，加入了中和劑后，檢出限為≤10 cfu/g，說明中和劑已經(jīng)完全消除了防腐劑的抑菌性能，檢測結(jié)果更加準確?！痘瘖y品衛(wèi)生規(guī)范》中檢測菌落總數(shù)用含卵磷脂、吐溫80的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，由于卵磷脂、吐溫80對卡松類的防腐劑的中和效果有限，造成檢測限偏高，檢測結(jié)果不準確，而在稀釋液中加入中和劑，可中和防腐劑的抑菌效果，因此，檢測時加入中和劑，可提高檢測靈敏度。
五、可改進項
1、 中和劑的選擇
化妝品通常添加了防腐劑,《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》選用吐溫- 80和卵磷脂配合作為中和劑，但該中和劑消除防腐劑的效果有限，對于多數(shù)化妝品只能降低部分防腐劑的效果，因此，對于化妝品的微生物檢測需要了解化妝品中加入防腐劑的種類，而對于不同防腐劑，需要根據(jù)中和劑鑒定試驗來評價中和劑的效果 。
2、TTC的影響
雖然可以使菌落變紅色，有利于菌落計數(shù)，但不同產(chǎn)品中的細菌對于TTC的敏感性不同，TTC的加入對產(chǎn)品中菌落總數(shù)的檢測結(jié)果影響很大，因此，一般情況下，建議不加TTC，如果化妝品中的顆粒影響計數(shù)，不得不加入TTC，建議減少TTC的含量，至于加入TTC的具體濃度,還有待于進一步探討。
3、 稀釋液
建議將生理鹽水改為SCDLP或相應(yīng)的中和液。
4、 培養(yǎng)基的選擇
菌落總數(shù)培養(yǎng)基，增加胰蛋白胨。
霉菌和酵母菌培養(yǎng)基，在虎紅（孟加拉紅）培養(yǎng)基基礎(chǔ)上增加卵磷脂和吐溫80，進一步中和防腐劑的抑菌作用。
5 增加方法有效性驗證試驗
化妝品中微生物檢測方法的有效性判斷極其重要，如果檢測方法不完善，可能導致檢測結(jié)果不準確，這對于產(chǎn)品的安全性和消費者的身體健康都會帶來潛在的危害。在膏霜類化妝品中，微生物都是吸附或附著于顆粒狀的原料中，檢測時不易洗脫下來，因此，需要驗證檢測方法的有效性，可通過添加標標準菌的方法驗證，參考有關(guān)行業(yè)的標準和本試驗結(jié)果，建議以加標菌回收率至少達到70%作為檢測方法有效性的標準。
綜上，在化妝品檢驗過程中仍會出現(xiàn)檢不出菌，或者未檢出仍然發(fā)生腐壞的現(xiàn)象，未檢出≠無菌，無菌≠不發(fā)生腐壞，具體操作仍需要考慮體系的配伍性、微生物特異性以及是否嚴格做了3個稀釋度仍未檢出……
迪美生物——
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